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RNA 的提取和纯化实验
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发布时间：2025-04-02
| 氯仿焦碳酸二乙酯乙醇异丙醇苯酚-胍盐单相溶液磷酸盐缓冲液 |
| 离心机和转头移液器离心管锥形管平板匀浆器 |
| 一、材料1.缓冲液、溶液和试剂氯仿焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的H20(GenHimterR105)乙醇70%乙醇洗液（用DEPC处理过的H20配制）异丙醇苯酚-胍盐单相溶液（推荐RNApure,GenHunterP501-P503)磷酸盐缓冲液（PBS)2.离心机和转头小离心机3.专用设备50ml锥形管1.5ml小离心管1000ul(原文为ml。—译者改）移液器100~150mm平板P10移液器Pdytron匀浆器（用于从组织中提取RNA)二、方法第一步：RNA提取方法1:从组织培养物中提取RNA1.如果细胞贴在瓶壁或平板上，则倒掉培养基，将平板置于冰上。2.如果细胞是悬浮的，旋转离下细胞，并除去培养基。3.用10~20ml的冷磷酸盐缓冲液（PBS)漂洗细胞。4.倒掉PBS，并用1000ul移液器吸去残留的PBS。5.每100~150mm平板加入2ml苯酚-胍盐单相溶液（RNApure)，以裂解细胞（摇晃平板使溶液分布均匀）。这个体积足够裂解100万~1000万个细胞。6.将平板放在冰上10min。7.将裂解液吸到两个标记好的1.5ml离心管中。方法2:从组织中提取RNA1.在装有组织的50ml锥形管中，加入至少2ml苯酚-胍盐单相溶液（RNApure),并置于冰上。组织和酚溶液的理想比例至少应该是1:10。2.用Polytron匀浆器将组织搅匀，直到组织完全分散为止。3.将管子置于冰上10min。4.取1ml裂解液，分装到标记好的1.5ml离心管中。方法3:从血液中提取RNA1.将血液产品离心，并除去血浆。2.按照上面从组织中提取RNA的说明逬行操作。第二步：RNA的纯化1.每毫升裂解液加入150ul氯仿，涡旋混匀10min。本方案可以在此处停止，并将裂解液放置在-80°C2.在4°C以最大转速离心10min。3.小心地将上清液转移到一个干净的、标记好的1.5ml离心管中。4.加入等体积的异丙醇，并在冰上放置10min，然后剧烈地混匀或涡旋混匀30s。5.将混合物在4°C以最大转速离心10min。6.用1ml预冷的70%乙醇（用DEPC处理过的H20配制）洗涤RNA沉淀，在4°C最大转速离心2min。7.倒掉乙醇。短暂离心后，用移液器吸去残留的洗液。8.将RNA在5ulDEPC处理过的H20中重新悬浮。注意：如果RNA用于任何扩增反应，悬浮液中不要使用SDS。9.取1ulRNA(用P10移液器）测定浓度，用1mlH20稀释。在260nm下读数，注意1OD260=40ug。 |
本文链接： http://genhunter.immuno-online.com/view-1533505713.html
发布于 ： 2025-04-02
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